蛋白穩(wěn)定性分析儀用于開發(fā)新型疫苗
應用案例（蛋白穩(wěn)定性分析儀-PSA-16）：PSA用于開發(fā)新型疫苗
蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16助力武漢大學病毒學國家重點實驗室科研工作者于2024年8月份在Nature子刊《npj Vaccines》雜志上發(fā)表論文“An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadlyneutralizing antibodies and protects againstlethal Nipah virus infection"。本研究以尼帕病毒G蛋白頭部域為抗原靶標，成功開發(fā)出一種新型的、安全有效的自組裝蛋白納米顆粒疫苗，該疫苗能夠誘導抑制多種亨尼帕病毒感染的廣譜中和抗體，并對尼帕病毒感染的倉鼠提供保護。
Zhou, D. et al.
npj Vaccines 9, 158 (2024).
蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)多肽鏈在溫度影響下的形變能力，主要體現(xiàn)在溫度改變時多肽鏈的化學特性和空間構象的變化，變化越小熱穩(wěn)定性越高。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性受到不同溫度、pH值、離子強度等外界因素的影響，在生物技術、藥物研發(fā)以及食品工業(yè)等領域，具有重要意義。
蛋白質(zhì)變性溫度是生物學家們研究蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的一個重要的概念，是指蛋白質(zhì)在特定溫度條件下受到熱力作用時，其結(jié)構發(fā)生變化的溫度點，一般溫度較高時，蛋白質(zhì)從穩(wěn)定的三維結(jié)構變化成松散的無序結(jié)構。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性一般使用熱變性中點溫度（Tm）來表示，即蛋白質(zhì)解折疊50% 時的溫度。
01 前言
尼帕病毒（NiV）是一種負義單鏈RNA病毒，ZUI初是在1998年至1999年馬來西亞和新加坡爆發(fā)期間分離和鑒定的。NiV感染可導致嚴重的腦炎和呼吸道疾病，病死率高達75%。另外在幸存者中也觀察到長期神經(jīng)系統(tǒng)疾病和NiV感染復發(fā)。目前，還沒有批準的可用于人類的疫苗或治療方法。NiV編碼一種病毒膜蛋白：糖蛋白（G），G蛋白位于病毒表面，負責受體識別和結(jié)合，受體結(jié)合后，G蛋白經(jīng)歷一系列構象變化，完成與靶細胞的膜融合，從而幫助病毒進入靶細胞并引發(fā)感染。此外，許多中和和保護性抗體主要針對G蛋白，表明G病毒蛋白是疫苗開發(fā)的關鍵抗原。最近已經(jīng)開發(fā)了多種針對NiV感染的疫苗平臺，包括亞基疫苗、mRNAs、病毒樣顆粒（VLP）、病毒載體疫苗和DNA疫苗，但還沒有對自組裝納米粒子平臺進行NiV感染評估。
02 摘要
作者設計了一種基于鐵蛋白的自組裝納米粒子，在表面顯示NiV G頭部結(jié)構域（NiV G-鐵蛋白，NiV G-ferritin），并評估了可溶性NiV G頭結(jié)構域（NiV sG）或NiV G-鐵蛋白引發(fā)的免疫反應，并且通過一系列研究數(shù)據(jù)表明NiV G鐵蛋白是一種安全有效的尼帕病毒感染候選疫苗。
03 結(jié)果
作者借助北京佰司特科技有限責任公司自主研發(fā)的蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16，通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理進行NiV G-ferritin和NiV sG的熱穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表現(xiàn)出相似的熱穩(wěn)定性，Tm為~65°C，表明NiV G和ferritin的融合對其結(jié)構穩(wěn)定性沒有顯著影響。
04 方法
蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16（北京佰司特科技有限責任公司）通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）測定靶蛋白的熱穩(wěn)定性。將樣品稀釋至0.5mg/mL，并將20μL稀釋后的樣品裝入石英玻璃管中。
使用23至97°C的線性溫度掃描，以1°C/min的加熱速度實時動態(tài)測量靶蛋白在280nm紫外激發(fā)下的330nm和350nm的熒光強度（F）。
根據(jù)F350nm/F330nm曲線的斜率計算熱變性中點溫度（thermal transition midpoint，Tm）。每個樣品平行測量四次。
Part 01. 實驗步驟
1） 在進行熱穩(wěn)定性實驗時，首先設置起始溫度。起始溫度ZUI低為15℃，可通過“+"“-"按鈕進行調(diào)整。
2） 設置完起始溫度后，接下來可以設置終點溫度。終點溫度ZUI高為110℃，可通過“+"“-"按鈕進行調(diào)整。
3） 設置完起始溫度和終點溫度后，接下來設置升溫速率。升溫速率可以在0.1-15℃/min范圍內(nèi)調(diào)整。
4） 可以根據(jù)樣品濃度的不同，選擇檢測靈敏度。高檢測靈敏度適合0.05-1 mg/ml的樣品，中檢測靈敏度適合1-10 mg/ml的樣品，低檢測靈敏度適合10 mg/ml以上的樣品。
5） 設置好以上參數(shù)之后，可以點擊選取需要檢測的樣品，并可以輸入樣品名。選中的樣品會以藍色方框提示。
6） 參數(shù)設置完成后，即可點擊“預掃描"按鈕。儀器會對樣品進行掃描，檢查熒光值是否符合實驗要求。
7） 在預掃描通過后，即可點擊“開始實驗"按鈕進行熱穩(wěn)定性測試。
Part 02. 實驗結(jié)果
8） 試驗完成后，軟件會自動進行數(shù)據(jù)分析并進入結(jié)果查看界面。
9）在結(jié)果查看界面，會顯示每個樣品的變性曲線，變性曲線的一階導數(shù)，變性溫度Tm值和變性起始溫度Ton值。
10）如有軟件無法自動識別的一階導數(shù)峰值，還可以通過“添加Marker"按鈕手動添加指示。
11）如需導出原始數(shù)據(jù)或者圖片，可通過“導出數(shù)據(jù)"和“導出圖片"按鈕實現(xiàn)。
作者也致謝了北京佰司特科技有限責任公司，提供自主研發(fā)的蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16，獲得蛋白樣品熱穩(wěn)定性分析的數(shù)據(jù)。
05 內(nèi)源差示掃描熒光法（inDSF）
內(nèi)源差式掃描熒光inDSF，基于蛋白質(zhì)中特定氨基酸的熒光特性。這些氨基酸的熒光強度與其所處的微環(huán)境密切相關，因此，當?shù)鞍踪|(zhì)的結(jié)構發(fā)生變化時，這些氨基酸的熒光信號也會隨之改變。不需要額外的熒光染料加入到檢測體系中，利用蛋白內(nèi)部芳香族氨基酸的自發(fā)光原理。不需要任何額外的標記或固定步驟，避免引入結(jié)果的不確定性。
研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)分子中芳香環(huán)氨基酸在處于不同極性的微環(huán)境時 (如疏水或親水環(huán)境中)，其被激發(fā)的內(nèi)源熒光的最大發(fā)射光譜會發(fā)生位移。蛋白質(zhì)中內(nèi)源熒光主要來自含芳香環(huán)氨基酸如色氨酸 (Trp)，苯丙氨酸 (Phe) 和酪氨酸 (Tyr)，其中以色氨酸內(nèi)源熒光ZUI強。當它在蛋白內(nèi)部時，發(fā)射光主要在330波段，當?shù)鞍滓坏┤フ郫B，暴露在溶劑中，發(fā)出的光就會從330波長紅移到350。所以通過280激發(fā)，檢測330/350的比值變化，就能測量蛋白質(zhì)的Tm值。
以色氨酸為例，在蛋白質(zhì)疏水的內(nèi)核微環(huán)境中，其內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長在330 nm左右，而在親水的極性微環(huán)境中，色氨酸的內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長則出現(xiàn)在350 nm左右。蛋白質(zhì)熱變性或者化學變性通常會導致色氨酸殘基周圍微環(huán)境的極性發(fā)生變化，使通常被包埋于蛋白質(zhì)疏水內(nèi)核的色氨酸逐漸暴露于親水的環(huán)境中，從而導致發(fā)射內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長發(fā)生紅移(Red Shift)，即向更大的波長區(qū)域 移動。
特點：內(nèi)源差式掃描熒光DSF無需復雜的樣品處理或標記步驟，實驗相對簡便。但不是所有蛋白質(zhì)都含有足夠的熒光基團，且可能會受其他基團影響。
06 蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16
北京佰司特科技有限責任公司于2023年推出了自主研發(fā)的第一款國產(chǎn)的蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16。
PSA-16的性能和參數(shù)達到進口設備的水平，價格卻遠低于進口產(chǎn)品，彌補了目前國產(chǎn)自主設備在蛋白穩(wěn)定性研究分析領域的空白。
主要參數(shù)★ 測定參數(shù)：Tm、Cm、ΔG等；
★ 樣品通量：16個；
★ 樣品體積：≤20 uL；
★ 濃度范圍：0.01-200 mg/ml；
★ 溫控范圍：15-110度；
★ 變溫速度：0.1-15度/分鐘；
★ Tm重復性：CV小于1%；
★ 耗材參數(shù)：一次性，無需清洗；
★ 八聯(lián)排設計，適配多通道移液器；
多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16基于內(nèi)源差示掃描熒光（ifDSF）技術，廣泛應用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究、蛋白質(zhì)類大分子藥物（抗體）優(yōu)化工程、蛋白質(zhì)類疾病靶點的藥物小分子篩選和結(jié)合力測定等領域，具有快速、準確、高通量等諸多優(yōu)點。蛋白質(zhì)中色氨酸/酪氨酸的熒光性質(zhì)與它們所處的環(huán)境息息相關，因此可以通過檢測蛋白內(nèi)部色氨酸/酪氨酸在加熱或者添加變性劑過程中的熒光變化，測定蛋白質(zhì)的化學和熱穩(wěn)定性。
PSA-16采用紫外雙波長檢測技術，可精準測定蛋白質(zhì)去折疊過程中色氨酸和酪氨酸熒光的變化，獲得蛋白的Tm值和Cm值等數(shù)據(jù)；測定時無需額外添加染料，不受緩沖液條件的限制且測試的蛋白質(zhì)樣品濃度范圍非常廣（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可廣泛用于去垢劑環(huán)境中的膜蛋白和高濃度抗體制劑的穩(wěn)定性研究。此外，PSA-16具有非常高的數(shù)據(jù)采集速度，從而可提供超高分辨率的數(shù)據(jù)。同時PSA-16一次最多可同時測定16個樣品，通量高；每個樣品僅需要15 uL，樣品用量少，非常適合進行高通量篩選。PSA-16操作簡單，使用后無需清洗，幾乎無維護成本。
多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16應用涵蓋植物、生物學、動物科學、動物醫(yī)學、微生物學、工業(yè)發(fā)酵、環(huán)境科學、農(nóng)業(yè)基礎、蛋白質(zhì)工程等多學科領域。蛋白質(zhì)是最終決定功能的生物分子，其參與和影響著整個生命活動過程?，F(xiàn)代分子生物學、環(huán)境科學、動醫(yī)動科、農(nóng)業(yè)基礎等多種學科研究的很多方向都涉及蛋白質(zhì)功能研究，以及其下游的各種生物物理、生物化學方法分析，提供穩(wěn)定的蛋白質(zhì)樣品是所有蛋白質(zhì)研究的先決條件。因此多功能蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析系統(tǒng)在各學科的研究中都有基礎性意義。
1. 抗體或疫苗制劑、酶制劑的高通量篩選
2. 抗體或疫苗、酶制劑的化學穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性評估、等溫穩(wěn)定性研究等
3. 生物仿制藥相似性研究（Biosimilar Evaluation）
4. 抗體偶聯(lián)藥物（ADC）研究
5. 多結(jié)構域去折疊特性研究
6. 物理和化學條件強制降解研究
7. 蛋白質(zhì)變復性研究（復性能力、復性動力學等）
8. 膜蛋白去垢劑篩選，膜蛋白結(jié)合配體篩選（Thermal Shift Assay）
9. 基于靶標的高通量小分子藥物篩選（Thermal Shift Assay）
10. 蛋白純化條件快速優(yōu)化等
