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熒光定量PCR的標準流程是怎樣的?
點擊次數(shù)：628 更新時間：2025-08-31
熒光定量PCR（Real-TimeQuantitativePCR，qPCR）是一種在PCR反應(yīng)過程中實時監(jiān)測熒光信號強度，從而實現(xiàn)對模板核酸（DNA或RNA）進行定量分析的技術(shù)。其標準流程可分為實驗前準備、樣本處理、逆轉(zhuǎn)錄（僅RNA模板）、qPCR反應(yīng)體系配制、上機擴增與數(shù)據(jù)分析、實驗后處理六個核心步驟，每個環(huán)節(jié)均需嚴格控制以保證結(jié)果的準確性和重復(fù)性。
一、實驗前準備：環(huán)境與試劑質(zhì)控
熒光定量PCR對污染和試劑純度極其敏感，此階段的核心是避免交叉污染、確保試劑有效性。
實驗環(huán)境準備
劃分獨立操作區(qū)域：嚴格區(qū)分“樣本處理區(qū)”“試劑配制區(qū)”“PCR擴增區(qū)”，避免氣溶膠污染（如擴增后的產(chǎn)物擴散到前序步驟）。各區(qū)需配備專用移液器、耗材（吸頭、離心管），并定期用紫外線（UV）或核酸清除劑消毒臺面和儀器。
儀器檢查：提前調(diào)試熒光定量PCR儀，確認溫度準確性（如梯度驗證）、熒光通道靈敏度（用標準品測試信號強度），確保儀器運行穩(wěn)定。
試劑與耗材準備
試劑選擇與儲存：根據(jù)實驗?zāi)康模ㄈ鏒NA定量、RNA定量、基因表達分析）選擇合適的qPCR試劑盒（含DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液、熒光探針/染料），以及逆轉(zhuǎn)錄酶（僅RNA實驗）、引物、探針、RNase抑制劑等。所有試劑需按說明書儲存（如-20℃冷凍保存，避免反復(fù)凍融，建議分裝成小份使用）。
耗材質(zhì)控：使用無RNase、無DNase的無菌吸頭和離心管，避免核酸酶降解模板；吸頭需帶濾芯（防止移液器內(nèi)氣溶膠污染）。
二、樣本處理：模板核酸提取與純化
模板的純度和完整性直接影響qPCR結(jié)果，此階段需高效提取核酸并去除雜質(zhì)。
樣本類型與預(yù)處理
常見樣本包括組織、細胞、血液、唾液、體液等。根據(jù)樣本類型進行預(yù)處理：如組織需研磨勻漿、細胞需胰酶消化收集、血液需離心分離血清/血漿或白細胞。
預(yù)處理過程中，RNA樣本需全程加入RNase抑制劑，避免RNA降解；樣本需新鮮處理，若無法立即提取，需按要求保存（如組織樣本-80℃冷凍，RNA樣本溶于RNase-free水或TE緩沖液）。
核酸提取
采用商業(yè)化提取試劑盒（如柱提法、磁珠法）或經(jīng)典方法（如酚氯仿法）提取DNA或RNA。核心步驟包括：裂解細胞釋放核酸→結(jié)合到吸附柱/磁珠上→洗滌去除蛋白質(zhì)、鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)→洗脫得到純凈核酸。
提取后需檢測核酸質(zhì)量：用紫外分光光度計測OD值（DNA的OD260/280比值應(yīng)在1.8~2.0，RNA應(yīng)在1.9~2.1，比值異常提示蛋白或雜質(zhì)污染）；用瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸完整性（如RNA需觀察28S和18SrRNA條帶，確保無降解）。
三、逆轉(zhuǎn)錄（RT步驟）：RNA→cDNA（僅RNA模板適用）
若檢測對象為RNA（如基因表達量分析、病毒RNA定量），需先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為穩(wěn)定的cDNA，再進行qPCR擴增。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制
在無RNase的離心管中，按比例加入以下成分：RNase-free水、RNA模板、Oligo(dT)引物/隨機引物、dNTPs、RNase抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液。體系需在冰上配制，避免酶活性提前激活。
引物選擇：Oligo(dT)結(jié)合mRNA的poly(A)尾，適用于完整mRNA逆轉(zhuǎn)錄；隨機引物可結(jié)合RNA任意區(qū)域，適用于降解RNA或非編碼RNA逆轉(zhuǎn)錄。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序
按逆轉(zhuǎn)錄酶說明書設(shè)置PCR儀程序，典型程序為：
引物退火：25~37℃孵育10~15分鐘（讓引物與RNA結(jié)合）；
逆轉(zhuǎn)錄延伸：42~50℃孵育30~60分鐘（逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA）；
酶滅活：70~85℃孵育5~10分鐘（終止反應(yīng)并滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）。
反應(yīng)結(jié)束后，cDNA可立即用于qPCR，或-20℃冷凍保存（短期）、-80℃長期保存。
